Tuto ELISA HD

TP : Test ELISA, détermination de la séropositivité d’un organisme.

 

Test ELISA : détermination de la séropositivité d’un organisme

ELISA est l’acronyme de : « Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay. »

Vous avez déjà entendu parler de séropositivité dans le cas du V.I.H mais cette notion s’applique à tout virus ou agent infectieux se retrouvant dans le sang d’un organisme.

Nous chercherons à déterminer si un lapin a été contaminé par un élément étranger appelé, BSA pour Sérum Albumine Bovine, une protéine bovine.

En effet, l’organisme réagit à l’introduction d’un élément étranger par la production d’anticorps anti-BSA.

Parmi vous, certains ont des sérums de lapin contaminé, d’autres non ! La question est donc de savoir qui travaille avec du sérum de lapin contaminé et qui travaille avec du sérum non contaminé.

Principe du test:

Un sérum de lapin contaminé par la BSA contient des anticorps Ac1 spécifiques de l’antigène BSA.

Si ces anticorps sont effectivement présents dans le sérum, ils reconnaissent l’antigène qui a été, au préalable, fixé au fond du puits. Des anticorps Ac2, spécifiques des anticorps Ac1, peuvent se fixer à Ac1 ; dans le protocole du test ELISA, ils sont fixés à une enzyme : la peroxydase. (D’où le nom de ce test) Cette enzyme catalyse une réaction colorée en présence d’un substrat incolore.

Matériel :

  • une barrette de 3 puits au fond desquels sont fixés des antigènes BSA (albumine de sérum bovine, une protéine);
  • un sérum de lapin contaminé par la BSA ;
  • une solution d’anticorps conjugué Ac2 = complexe entre anticorps et enzyme.
  • une pissette d’eau pure pour le rinçage, micropipettes (ou équivalent), des gants, un chronomètre, du papier filtre;
  • une solution de lavage ;
  • Une solution de substrat de l’enzyme peroxydase ; l’action de cette enzyme sur ce substrat se traduit par une coloration.

Activités de l’élève :

Appliquez le protocole suivant :

1-     Repérez les puits et déposez dans chacun d’eux 160µl (utilisez les micropipettes) des produits suivants :

Sérum d’un lapin contaminé par la BSA,

Eau distillée,

Sérum du lapin à tester ;

2-    Laissez incuber 15 minutes à température ambiante.

3-    Procédez au lavage de la manière suivante : videz le contenu de la barrette en la retournant énergiquement de manière à éviter le mélange des produits ; absorbez le liquide restant en tamponnant la barrette sur du papier filtre ; lavez à l’eau pure ; éliminez l’eau pure en secouant énergiquement la barrette.

4-    Lavez les puits : remplir tous les puits avec la solution de lavage et videz immédiatement comme précédemment. Répétez ce lavage deux fois ;

5-    Mettre dans le puits 160µl de la solution de conjugué Ac2 sur lequel est fixée l’enzyme péroxydase.

6-    Laissez agir 15 minutes.

7-    Videz les puits et les laver deux fois comme à l’étape 4.

8-    Mettre dans les puits 160µl de substrat de l’enzyme peroxydase. Attendre quelques minutes qu’une coloration éventuelle se développe.

Questions :

  • Précisez l’intérêt du test avec l’eau distillée et avec le sérum d’un lapin contaminé.
  • Justifiez les temps d’incubation des étapes 2 et 6 du protocole.
  • Présentez dans un tableau les résultats de la manipulation et les schémas d’interprétation correspondants. Ces schémas mettront en évidence les associations moléculaires (utilisez les symboles proposés)
  • Déduire des résultats obtenus si le lapin à tester a été contaminé.
  • Rangez le poste de travail.

test ELISA

 

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